天津本生解答：DNA提取方法的總結

　　天津本生解答：DNA提取方法的總結

　　細菌DNA的提取：

　　(一)

　　試劑：

　　1. 抽提緩沖液

　　2% CTAB (W/V)

　　2% PVP K25 (w/v) (去色素)

　　100mM Tris-HCl (pH8.0)

　　25mM EDTA (pH8.0)

　　2.0M NaCl

　　2.10M LiCl

　　3. 2M LiCl

　　4.DEPC-water(抑制RNA酶活性)

　　5. 3M NaAc (pH5.2)

　　6. 96% 乙醇

　　7. 70% 乙醇

　　細菌DNA的步驟：

　　1.抽提緩沖液65℃預熱;

　　2. 加菌體到已經預熱的緩沖液(700ul)中混勻，65℃，10min;

　　3. 加酚/LV仿/ywc(25：24：1)，振蕩，離心12,000rpm，10min;

　　4.取上清，加LV/ywc(24：1)振蕩，離心12,000rpm，10min;

　　5. 取上清，重復4步驟;

　　6. 加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇(或加入等體積的ybc)，-20C沉淀;

　　11. 離心12,000rpm，10min;

　　12. 棄上清，70%乙醇洗，也可以再用100%乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。

　　(二)(我們常用的方法，但是有時有些細菌特別不好提，就用上面的方法)

　　1. 將菌株接種于液體LB培養基，37℃震蕩培養過夜。

　　2. 取1.5ml培養物12000rpm離心2min。

　　3. 沉淀物加入567 ul的TE緩沖液，反復吹打使之重新懸浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h.

　　4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混勻，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10min。

　　5. 加入等體積的酚/LV/ywc混勻，離心4-5min, 將上清轉入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的ybc，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。

　　6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇.

　　真菌DNA的提取：

　　(一)

　　1.取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉

　　2.加入4mL提取液，快速振蕩混勻

　　3.加入等體積的4mL的LV:ywc(24:1)，渦旋3～5min(此處是粗提沒有加酚，可以節約成本的喲!)

　　4.1000rpm，4℃，5min

　　5.上清用體積的LV:ywc(24:1)再抽提一次(10,000 rpm，4℃離心5 min)

　　6.取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷ybc或2.5倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min

　　7.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復漂洗數次, 再用無水乙醇漂洗1次, 吹干，重懸于500 ?ulTE中

　　8.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL)，37℃處理1 hr

　　9.用酚(pH8.0):LV仿:ywc(25:24:1)和LV仿:ywc(24:1)各抽提1次(10,000 rpm，4℃離心5 min)

　　10.取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇, -70℃沉淀30 min以上

　　11.沉淀用75%乙醇漂洗，風干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存備用

　　DNA提取液：0.2M Tris-HCl(pH 7.5)，0.5M NaCl，0.01M EDTA，1%SDS，

　　3M NaAc

　　細菌DNA的細菌(二)

　　1.真菌菌絲0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉

　　2.加入3 mL 65℃預熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻65℃水浴30 min, 期間混勻2-3次

　　3.加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min

　　4.等體積的LV仿:ywc(24:1)抽提1次(10,000 rpm，4℃離心5 min)

　　5.取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷ybc, 混勻, 靜置約30 min

　　6.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復漂洗數次, 再用無水乙醇漂洗1次, 吹干，重懸于500 ?L TE中

　　7.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL)，37℃處理1 hr

　　8.用酚(pH8.0):LV仿:ywc(25:24:1)和LV仿:ywc(24:1)各抽提1次(10,000 rpm，4℃離心5 min)

　　9.取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇, -70℃沉淀30 min以上

　　10.沉淀用75%乙醇漂洗，風干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存備用。

　　注：僅供參考!